截至2009年，美洲国家组织有35个成员国，包括：阿根廷、安提瓜和巴布达、巴巴多斯、巴哈马、巴拉圭、巴拿马、巴西、古巴、秘鲁、玻利维亚、多米尼加、多米尼克、厄瓜多尔、哥伦比亚、哥斯达黎加、格林纳达、海地、洪都拉斯、加拿大、美国、墨西哥、尼加拉瓜、萨尔瓦多、圣卢西亚、圣文森特和格林纳丁斯、圣基茨和尼维斯、苏里南、特立尼达和多巴哥、危地马拉、委内瑞拉、乌拉圭、牙买加、智利、圭亚那和伯利兹。由于美国推行孤立古巴的政策，自1962年以来，美洲国家组织一直拒绝古巴参加活动。但在2009年的美洲国家组织全体大会上，包括美国在内的所有成员国一致同意恢复古巴的成员国资格。

共有64个国家或组织向美洲国家组织派遣常驻观察员，它们是：欧盟、德国、法国、西班牙、希腊、意大利、比利时、英国、芬兰、冰岛、瑞士、瑞典、丹麦、挪威、荷兰、葡萄牙、爱尔兰、卢森堡、梵蒂冈、奥地利、塞浦路斯、俄罗斯、波兰、捷克、斯洛伐克、罗马尼亚、匈牙利、保加利亚、克罗地亚、波斯尼亚和黑塞哥维那、斯洛文尼亚、塞尔维亚、乌克兰、亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚、哈萨克斯坦、拉脱维亚、爱沙尼亚、土耳其、埃及、摩洛哥、阿尔及利亚、尼日利亚、突尼斯、安哥拉、赤道几内亚、加纳、贝宁、瓦努阿图、卡塔尔、沙特阿拉伯、以色列、黎巴嫩、也门、日本、韩国、菲律宾、印度、巴基斯坦、斯里兰卡、泰国、中国和立陶宛。此外，美洲国家组织还邀请一些国家作为特别观察员出席其全体会议。

观察员是美洲国家组织全体大会在1971年通过决议正式设立的，须获常设理事会一致通过。常驻观察员有权参加美洲国家组织的任何会议，并在会上发言；也可应邀参加秘密会议；有权获得该组织所有公开散发的文件；无须缴纳会费，但有义务表明愿参加该组织主办的经济、技术合作项目。